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抗体的荧光素有必要具有的条件
点击次数:469 发布时间:2017/8/22

荧光强度(即发射荧光的光量子数)与激发光(吸收的光量子数)的强度有关,激发光越强,荧光也越强。荧光素能够发射红、橙红、黄、绿及蓝色等荧光。光的强弱也与荧光素溶液的pH值、浓度以及染色时刻和温度等条件有关。
荧光素的品种许多,但用于符号抗体的荧光素不同于一般荧光色素,它有必要具有以下条件。
①应具有与蛋白质分子构成共价键的化学基团,结合后不易离解其降解,而未结合的色素及产品简单排除。
②荧光功率高,与蛋白质结合后荧光功率下降不多。
③结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响,酶联免疫检测试剂盒用于活体内符号结合物应无毒性,附加抗原性小。
④与蛋白质结合的办法简洁而快速,结合物在一般条件下安稳。
⑤荧光素简单溶解,溶解后不会和其他物质发作化学反应。
⑥荧光色彩与布景安排的自发荧光色彩比照明显,能明晰判别成果。
用于符号抗体和蛋白质的荧光色素到目前为止有几十种,下面举几种传统的、较为常用的荧光素。
异硫氰酸荧光黄(fluoreseicnisothiocyanate,FITC)纯品为黄色粉末,有两种异构体,易溶于水和乙醇等溶剂,在溶解状态下呈黄绿色荧光。性质安稳,低温干燥下可保存多年,室温下也可保存2年以上。FITC分子质量为390Da,最大吸收光谱为490~495nm,最大发射光谱为520—530nm,出现亮堂的黄绿色荧光,其间异构体I型荧光功率更高,与蛋白质结合更安稳。
在碱性条件下,FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自在氨基经碳酰胺化而构成硫碳氨基键,结合成为符号荧光免疫球蛋白,即荧光抗体。一个IgG分子上最多能符号15~20个FITC分子。
四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)是一种紫红色粉末,较安稳,是罗丹明(Rhodamine)的衍生物,易溶于水。最大吸收光谱为550nm,最大发射光谱为620nm,呈橙红色荧光,与FITC发射的黄绿色荧光比照明显,常常用于双符号染色,运用较多。
四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200,RB200)是褐红色粉末状,溶于乙醇和丙酮,不溶于水,最大吸收光谱570nm,最大发射光谱596~600nm,呈橙红色荧光。由于RB200比较价廉,广泛用于免疫荧光组化染色和双符号示踪或染色,RB200不能直接和蛋白质结合,要先经五氯化磷(PCIs)效果下转变成磺酰氯(SOzCl),在碱性条件下易与赖氨酸‘氨基反应而结合在蛋白分子上。其分子质量为580Da。

 
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