各位访客大家好!今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于westernblot试剂盒的问题，于是小编就整理了几个相关介绍的解答，让我们一起看看吧，希望对你有帮助
Western-blot实验ECL发光检测实验步骤
1、第一步：敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，来回磨，至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。
2、（1）转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
3、（2）验漏：将胶板安装在胶架上，向胶板内注满ddH2O，静置2min，观察是否渗漏。如果渗漏，重新装配胶板胶架。（3）风干、冷却：确定胶板不渗漏后，弃ddH2O，用吹风机吹干胶板，之后置于通风橱中等待其冷却。
ECL发光试剂盒AB液混合后就发光正常吗
1、这肯定是不对的，因为发光反应必须要有催化剂才行。HRP可以催化这个发光反应，铁离子等杂质也可以。不加催化剂就发光是因为混进了杂质。
2、Western-blot中ECL发光液的选择很重要，Enlight-Plus检测级别可达pg级，发光时间长，背景低，得到的图像很漂亮，非常有利于实验的进行。
3、重复步骤3以去除未结合的HRP-结合物 6 将A液和B液以1：1混合即得到超敏ECL化学发光工作液，推荐使用量为0.1mL/cm2。7 将工作液与印迹膜于室温孵育5min。
4、仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合A液和B液，混合后尽快使用。
5、把一抗、洗涤和封闭的原因排除之后，仍然有整张膜发光，那就是发光液的质量问题。所以选择质量好的发光液关乎实验成败。
SDS-PAGE和western-blot有区别吗
SDS-PAGE胶电泳 将样品中的蛋白质根据分子量大小进行分离是Western blot的关键步骤。通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来实现这一目的。
前面·我们已经介绍过SDS-PAGE，电泳完成后如果要进行western blot则需要转膜 转膜：转膜有湿转和半干转两种不同方法。
再与酶或同位素标记的第二抗体起反应。组织定位不同：免疫组化在组织定位和定性上比较准确，但是在定量上不够准确。western blot因为有内参标定，所以在定量上要更加准确，但是在组织定位上不如免疫组化。
(2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
主要是两点不同：抽提方法不同。利用不同的抽提试剂或方法，分离不同的组分用于检测，可以有助于提高检测灵敏度。
wb不同分子量的蛋白需要洗膜吗?
1、可以。根据查询《WB膜的重复使用及显色》得知，如果所测的蛋白分子量差距比较大的话，是不需要褪膜的，因此wb分子量差别大可以不用膜再生液。
2、(使用RIPA裂解液是需按照100：1加入蛋白酶抑制剂)。电泳：根据蛋白大小确定合适的PAGE胶浓度，推荐上样量为20-30ug总蛋白。转膜：湿转和半干转都可。但在待检测蛋白分子量较大或低内源水平湿转移方法更佳。
3、减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中NaCl浓度等； ⑥抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间； ⑦甲醇浓渡过高。
4、会，但是不建议洗掉。因为最后显色是依赖于膜上结合的二抗，二抗带有酶标记，通过酶与化学发光底物反应，产生信号，从而曝光可得结果。
5、如果胶浓度不同，蛋白在其中迁移的速率就不一样，所以如果采用裁膜的方式，对于蛋白迁移的位置要事先有个预判。10%的胶，浓度高，迁移慢一些，如果都在相同位置裁，这里看到条带，6，8%的胶，膜需要裁得更靠下缘。
做westernblot前蛋白是怎么提取的
肯定是从细胞里提取喽，裂解细菌细胞可以用化学试剂（试剂盒）或者用超声（注意不要让温度太高，最好冰浴，防止蛋白失活），之后就是SDS的步骤了，跑完胶之后才是western blot.有条件可以搜搜别人的protocal之类的。
首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白，通常使用细胞裂解和蛋白质抽提试剂盒来破坏细胞膜并释放蛋白质。然后，通过离心等步骤将提取的样品进行纯化和富集，以消除杂质和其他蛋白质的干扰。
蛋白样品提取：试剂：RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂 （1）取出含有细胞的6孔板，置于冰上进行操作 （2）吸出培养液，加入1ml预冷的PBS清洗一遍，加入PBS时务必沿着板壁注入，避免触碰到孔板底部导致细胞脱落。
从-80度冰箱取出的蛋白要做Western Blot实验，需要先进行组织蛋白的提取和总蛋白的测定。组织蛋白的提取： 准备组织细胞裂解液，将1000ul RIPA和10ul PMSF加入到5ml EP管中，充分混合。
因此，在第一步中提取的蛋白上清液即是同等质量下，同样提取方法下，抽提的总蛋白混合物，这里面包含了各种各样的蛋白。
做好westernblot需要注意各种细节,转给需要的你!
一般是与转膜和显影的操作有关，转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。
（1）配制一抗：按照一定比例稀释抗体，并将配好的抗体置于夹链袋中。（2）裁膜：将NC膜多余的部分裁去。
把一抗、洗涤和封闭的原因排除之后，仍然有整张膜发光，那就是发光液的质量问题。所以选择质量好的发光液关乎实验成败。
原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
大分子蛋白和小分子蛋白做western blot其实要求是一样的，区别就在于大分子蛋白跑得慢，所以电泳和转膜需要的电压或电流更大，时间更长，当然，一般大分子蛋白需要用低浓度胶，而小分子蛋白则选择高浓度胶。
以上内容就是解答有关westernblot试剂盒的详细内容了，我相信这篇文章可以为您解决一些疑惑，有任何问题欢迎留言反馈，谢谢阅读。
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