t载体试剂盒,t载体作用 -上海生物商贸有限公司

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真核基因在原核系统表达的主要步骤

获取目的基因：最简单的是直接从cDNA文库找，不然就要自己用mRNA逆转录出cDNA，然后PCR，电泳检测，回收。酶切和连接：找一个质粒载体，根据载体的说明书选择内切酶，一般是双酶切。

请删去基因中的内含子。这可以通过将该基因的cDNA连接至载体中而解决。所用的表达载体中，你所需要表达的基因必须由宿主菌能够使用的原核启动子来启动。一般商业的原核表达载体均有这类启动子。

比如pET系列，含有原核启动子，终止子相同，不需要考虑SD序列，载体启动子中都有了。将真核基因编码框（CDS）序列重组进载体，转化大肠杆菌就可以表达了。表达产物没有糖基化修饰，表达量不好说依基因的不同相差很大。

结合、RNA聚合酶的募集以及新合成RNA分子的延伸。真核生物中的核膜通过允许这些转录因子在细胞核中存在的持续时间来进一步调控转录环境刺激或内分泌信号可能导致调节蛋白的修饰，引发细胞内信号的级联，导致基因表达的调节。

从基因结构看，由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达。具体的说，真核细胞的基因结构在编码区是由不能够编码蛋白质的内含子和能够编码蛋白质的外显子组成。

我做过几个克隆，没用过T载体，直接将酶切后纯化的产物进行连接，照样可以连接成功，基本上都会有10-50个克隆长出来。我用的是Sal I和Nde I这两个酶切位点，似乎这两个都是平端的哦。

T载体是一种克隆载体，也就是用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体，它不能大量表达。

t载体就是T-DNA，是一类可以重组到受体生物染色体上的载体，通常被应用于植物的基因重组过程中。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。

T载体是为了再次确定你获得的目的基因是你想要的目的基因，并且克隆到T载体上可以保存目的基因。

1、标准曲线的制作（1）将阳性菌株，接种到含氨苄抗性的lb培养基中，37℃ 200 r/min，摇菌过夜。（2）提取质粒，通过单酶切后，回收酶切产物。（3）测浓度，计算拷贝数，制成标准品。

2、DNA的回收使用AXYGEN公司AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，回收步骤如下：在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。

3、最好是用试剂盒附带的洗脱液洗脱，然后用同一公司的连接、转化试剂盒，一般不会有影响，同公司的产品在设计的时候会考虑这些因素进去的。还有就是你可以试试P两次，把两次的胶放在一起回收，然后洗脱液少加点。

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