大家好！小编今天给大家解答一下有关一步法rtpcr试剂，以及分享几个rtpcr一步法和两步法的区别对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。

RT-PCR实验操作的注意事项

以电泳为基础的半定量RT-pcr本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，半定量RT-PCR应该再两 管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。

⑹70度10分钟结束反应(此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰)，产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。3 RT-PCR的引物设计RT-PCR引物设计和一般PCR引物设计可以遵循同样的原则。细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。

RT-PCR 的关键步骤在是 RNA 的反转录，要求 RNA 模版为完整的且不 含 DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞 病毒反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒反转录酶。

实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。

一步法和两步法RT-PCR的根本区别?

1、其实一步法并非是两步法的改进，根据实验目的不同，有时两步法会更好。

2、一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。

3、两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。

4、RT-PCR 目前有一步法和两步法：一步法是以总RNA为模板，在一管反应中既实现了RT的过程又实现了PCR的过程。

HIV核酸检测的HIV核酸检测方法及程序

HIV核酸定量检测主要基于靶核酸扩增RT-PCR和信号放大扩增两种方法。

核酸检测里面有两种，其中他们两种包括：HIV-1 DNA检测和HIV-1 RNA检测，直接打击HIV的RNA或DNA结构，直接可以检测血液中是否存在病毒核酸，诊断是否存在病原体感染。

核酸提取均采用磁珠法。1）磁珠提取的原理：将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附核酸，并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中提取出来。

初筛，初筛可以采用快速检测法，也可以采用ELISA法或化学发光法。不管采用哪种方法，均推荐使用高敏感性的试剂，尽量做到对感染者不漏检。

核酸检测目前都是取咽拭子的方法（病毒感染口腔粘膜上皮后会寄宿于口腔粘膜上皮，通过采咽拭子达到取样目的），1 小时内送到专门检测室内进行。

艾滋病核酸检测是最准确的一种检测方法，核酸检测就是使用PCR的方法，检测患者血液中是否存在艾滋病的病毒。

RT-PCR检测方法的具体步骤

1、rtpcr操作有5个步骤。具体操作如下：总RNA提取。DEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，备反转录之用。反转录。

2、℃放置60min，70℃放置5min终止反应。3．稀释母液模板，进行PCR反应。

3、在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。步骤：（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

4、解RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。

5、RT-PCR步骤 总RNA提取 取200mg组织，放到5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。 震荡30s。 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 12000×g，4℃ 离心，15min。

6、实验步骤 实验原理 1 所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。 去除RNA酶（外源）的影响。

RT-qPCR知识点

1、rtqpcr原理及应用如下：原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

2、rt-qpcr全称为实时荧光定量（Real Time Quantitative）RT-qPCR属于第二代PCR技术，与常规的PCR技术相比，RT-qPCR技术可对DNA起始模板进行定量，同时可以对整个扩增反应进行实时监控。

3、实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR， 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。

4、【q-RT-PCR技术】就是结合了荧光定量技术的反转录PCR（反转录是以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式）：先从RNA反转录得到cDNA（RT），然后用Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。

5、qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。

6、Real-time PCR（实时荧光定量PCR）也可以缩写为RT—PCR，此外还有一个qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ），有人可能将这三者搞混。

RNA病毒的PCR

提取组织RNA1．准备好冰盒、5mlEP管(无RNA酶)、剪刀及镊子（需消毒，再用灭菌纯水和DEPC水洗净）、钻头、灭菌纯水等。取出冻存管，剪取约0.5cm放于EP管。

首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。

QRT PCR一般指以RNA为模板，先逆转成cDNA，再进行qPCR。更容易突变，因此种类更多，更难研制有效疫苗，难以预防。RNA病毒的抵抗力普遍比DNA病毒弱，治愈也更容易。

最终荧光定量PCR的原理是一样的，检测RNA只是比检测DNA多了一个逆转录的步骤。由于RNA是单链且不稳定，所以会先逆转录成DNA再进行PCR扩增。

在实际中，使用了特殊的含有荧光剂的引物，光学检测相应光强度的产物所需的循环数，能高度灵敏的达到目的。 realtime-PCR有两种。绝对定量和相对定量。 绝对定量常用于逆转录病毒侵染细胞的检测。

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